NeuroCog II scRNA-Seq Lab
Loyal Goff
2/21/2019
Dataset description
Importing Preprocessed Data
This tutorial assumes that we have already performed the initial preprocessing of the data using the cellRanger pipeline from 10x Genomics. One of the end results of this preprocessing is a genes X cells matrix of Unique Molecular Identifier (UMI) counts. E.g.:
| cell1 | cell2 | cell3 | |
|---|---|---|---|
| gene1 | 0 | 2 | 0 |
| gene2 | 15 | 7 | 3 |
| gene3 | 1 | 0 | 2 |
…
So let’s import the raw count data from the cellRanger output. The key files here are matrix.mtx, barcodes.tsv, and genes.tsv.
cellranger_dir <- 'data/10x/preprocessed'
raw <- load_cellranger_matrix(cellranger_dir)## Searching for genomes in: data/10x/preprocessed/outs/filtered_gene_bc_matrices_mex
## Using mm10 in folder: data/10x/preprocessed/outs/filtered_gene_bc_matrices_mex/mm10
## Loaded matrix information
## Loaded gene information
## Loaded barcode information
## Could not find summary csv:
## data/10x/preprocessed/outs/metrics_summary.csv.
## This file is only necessary if you are performing depth-normalization (calling the equalize_gbms function) in R.
## If this pipestance was produced by `cellranger aggr` with the default parameters, depth-normalization in R (via equalize_gbms) is not necessary.#saveRDS(raw,'data/raw.rds')raw## GeneBCMatrix (storageMode: environment)
## assayData: 27998 features, 55371 samples
## element names: exprs
## protocolData: none
## phenoData
## sampleNames: AAACCTGAGACACTAA-1 AAACCTGAGACCCACC-1 ...
## TTTGTCATCTCCGGTT-10 (55371 total)
## varLabels: barcode
## varMetadata: labelDescription
## featureData
## featureNames: ENSMUSG00000051951 ENSMUSG00000089699 ...
## ENSMUSG00000095742 (27998 total)
## fvarLabels: id symbol
## fvarMetadata: labelDescription
## experimentData: use 'experimentData(object)'
## Annotation:Data cleaning and Annotation
We would also like to add a bit of external information about the genes and samples (cells) to help us make some better interpretations downstream.
# Prep for CDS
fd <- fData(raw)
#change default feature column names to Monocle-friendly terms
colnames(fd) <- c("gene_id","gene_short_name")
# Prep for CDS
pd <- pData(raw)
# Extract sample 'number' information from barcode (cell_id) substring
pd$sample_num<-as.numeric(str_sub(pd$barcode, start= 18))Merge in external annotations
sample_info<-read.csv('data/annotation/sample_aggregation.csv',header=T)
master_sample_sheet<-read.csv('data/annotation/sample_info.csv',header=T)
#Merge cellranger aggr data with external annotation
sample_info<-merge(sample_info,master_sample_sheet,by.x="library_id",by.y="sample_id",sort = FALSE)
#Merge all annotation with pd
pd<-merge(pd,sample_info,by.x='sample_num',by.y=0,sort=F)
rownames(pd)<-pd$barcodeThe CellDataSet object
Many R packages for high-throughput sequencing data use a general structure for data organization (Class) derived from the Bioconductor ExpressionSet object. The Monocle package defines the CellDataSet class, which inherits from ExpressionSet, to hold and manipulate single cell RNA-Seq data. The layout of a CDS object is roughly as follows:
Schematic of the Monocle CellDataSet class
Here we create the Monocle CellDataSet object from our imported, cleaned, and annotated data
Create monocle CDS object
dat <- newCellDataSet(exprs(raw),
phenoData = new("AnnotatedDataFrame", data = pd),
featureData = new("AnnotatedDataFrame", data = fd),
lowerDetectionLimit = 0.5,
expressionFamily = negbinomial.size())
dat## CellDataSet (storageMode: environment)
## assayData: 27998 features, 55371 samples
## element names: exprs
## protocolData: none
## phenoData
## sampleNames: AAACCTGAGACACTAA-1 AAACCTGAGACCCACC-1 ...
## TTTGTCATCTCCGGTT-10 (55371 total)
## varLabels: sample_num barcode ... Size_Factor (26 total)
## varMetadata: labelDescription
## featureData
## featureNames: ENSMUSG00000051951 ENSMUSG00000089699 ...
## ENSMUSG00000095742 (27998 total)
## fvarLabels: gene_id gene_short_name
## fvarMetadata: labelDescription
## experimentData: use 'experimentData(object)'
## Annotation:Subsetting cells
For the purposes of this lab, and to allow for things to run in a reasonable timeframe, we are going to reduce the number of cells we will consider randomly by ~ 90%. (This is not normally done, but we won’t get through much in this lab unless we cull).
#sampleFactor<-0.1
#sampleCellBarcodes<-sample(rownames(pData(dat)),dim(dat)[2]*sampleFactor)
#write.csv(sampleCellBarcodes,'data/annotation/sampleCellBarcodes.csv')sampleCellBarcodes<-read.csv('data/annotation/sampleCellBarcodes.csv',stringsAsFactors = FALSE)$x
dat<-dat[,sampleCellBarcodes]
dat## CellDataSet (storageMode: environment)
## assayData: 27998 features, 5537 samples
## element names: exprs
## protocolData: none
## phenoData
## sampleNames: ACACCGGTCACTTCAT-10 TCGTAGAAGCTAAACA-6 ...
## GTTACAGAGTGTACTC-4 (5537 total)
## varLabels: sample_num barcode ... Size_Factor (26 total)
## varMetadata: labelDescription
## featureData
## featureNames: ENSMUSG00000051951 ENSMUSG00000089699 ...
## ENSMUSG00000095742 (27998 total)
## fvarLabels: gene_id gene_short_name
## fvarMetadata: labelDescription
## experimentData: use 'experimentData(object)'
## Annotation:Data QC and Filtering
Before we can start to process the data, we first need to get some summary statistics such as a scaling factor and an estimate of the dispersion for each gene (variance in excess of what is expected for a given model fit).
dat<-estimateSizeFactors(dat)
dat<-estimateDispersions(dat,cores=4)## Processing block 1/1 ... OK## Warning in log(ifelse(y == 0, 1, y/mu)): NaNs produced## Warning: step size truncated due to divergence## Removing 79 outliers#saveRDS(dat,'data/dat.rds')Number of Expressed Genes
It’s a good idea, and saves time/effort to identify and only consider genes whose expression levels are detected in a certain number or proportion of cells within your assay.
dat<-detectGenes(dat)
cellCutoff<-20
expressed_genes <- row.names(subset(fData(dat),
num_cells_expressed >= cellCutoff))
hist(fData(dat)$num_cells_expressed,col="red",breaks=50,main="Number of cells expressing a given gene")
hist(log10(fData(dat)$num_cells_expressed),col="red",breaks=50,main="Number of cells expressing a given gene")
abline(v=log10(cellCutoff),lty="dashed")
We have now identified a total of 14241 that are detectably expressed in at least 20 cells in our dataset.
Distribution of detected genes across cells
hist(pData(dat)$num_genes_expressed,col="darkgreen",breaks=50,main="Number of genes expressed per cell")
Mt-genome
A high proportion of mitochondrial genes may indicate a lower than ideal capture efficiency for a given cell.
mito_genes<-fData(dat)$gene_id[grepl("^mt-",fData(dat)$gene_short_name)]
pData(dat)$mt_reads <- Matrix::colSums(exprs(dat)[mito_genes,])
pData(dat)$total_reads <- Matrix::colSums(exprs(dat))
pData(dat)$mito_ratio <- pData(dat)$mt_reads/pData(dat)$total_reads
ggplot(pData(dat),
aes(x = num_genes_expressed, y = mito_ratio)) +
geom_point() +
labs(x = "Number of genes", y = "Mitochondrial ratio") +
scale_color_brewer(palette = "Set1") +
theme(legend.position = "none")
Mean RNA copies per cell
fData(dat)$mean_cpc<-Matrix::rowMeans(exprs(dat))
hist(log10(fData(dat[expressed_genes,])$mean_cpc),col="purple",breaks=50)
Selection of High-Variance Genes
disp_table = dispersionTable(dat)
disp_table = disp_table %>% mutate(excess_disp =
(dispersion_empirical - dispersion_fit) / dispersion_fit) %>%
arrange(plyr::desc(excess_disp))
expression_cutoff<-1e-04
top_subset_genes = intersect(fData(dat)$gene_id[fData(dat)$mean_cpc>=expression_cutoff],disp_table$gene_id[disp_table$excess_disp>0])
#top_subset_genes = as.character(head(disp_table, 1000)$gene_id)
dat <- setOrderingFilter(dat, top_subset_genes)
plot_ordering_genes(dat)## Warning: Transformation introduced infinite values in continuous y-axis
Monocle Preprocessing
To analyze a single-cell dataset, we will next normalize expression values to account for technical variation in RNA recovery across cells and for sequencing depth.
#log-transform and initial PCA
dat <- preprocessCDS(dat, method = 'PCA',
norm_method = 'log',
num_dim = 25, #Arbitrary....I should look at scree plot.
verbose = T)## Remove noise by PCA ...## Processing block 1/1 ... OKDimensionality Reduction
A crucial next step is to summarize the set of significant learned principal components into an interpretable set of dimensions (e.g. 2).
#UMAP dimensionality reduction
dat <- reduceDimension(dat, max_components = 2,
reduction_method = 'UMAP',
metric="correlation",
#metric="cosine",
#min_dist = 0.75,
#n_neighbors = 50,
verbose = T
)## Retrieving normalized data ...## Running Uniform Manifold Approximation and ProjectionCell Clustering
Cluster Cells
dat <- clusterCells(dat,
method = 'louvain',
res = 1e-3,
#res = NULL,
louvain_iter = 1,
verbose = T)## Warning in if (cell_names != row.names(pd)) stop("phenotype and row name
## from the data doesn't match"): the condition has length > 1 and only the
## first element will be used## Run kNN based graph clustering starts:
## -Input data of 5537 rows and 2 columns
## -k is set to 20## Finding nearest neighbors...DONE ~ 0.025 s
## Compute jaccard coefficient between nearest-neighbor sets ...DONE ~ 0.003 s
## Build undirected graph from the weighted links ...DONE ~ 0.032 s
## Run louvain clustering on the graph ...
## Running louvain iteration 1 ...## Current iteration is 1; current resolution is 0.001; Modularity is 0.900082750362549; Number of clusters are 19## Maximal modularity is 0.900082750362549; corresponding resolution is 0.001##
## Run kNN based graph clustering DONE, totally takes 0.335412979125977 s.## -Number of clusters: 19Visualizations
cell_size<-0.2
pdf("figures/initial_clustering.pdf")
plot_cell_clusters(dat,color="Cluster", cell_size=cell_size, show_group_id = T) + guides(color=FALSE) + coord_equal(1)
plot_cell_clusters(dat,color="Genotype", cell_size=cell_size) + scale_color_manual(values=c("red","grey40"))
plot_cell_clusters(dat,color="Sex", cell_size=cell_size) + scale_color_manual(values=c("orange","darkblue"))
plot_cell_clusters(dat,color="library_id", cell_size=cell_size)
dev.off()## quartz_off_screen
## 2Annotating cells by marker gene expression
Some (not all) of the markers came from here http://casestudies.brain-map.org/celltax
pdf("figures/Markers.pdf",width=15,height=15)
#Interneuron markers
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Gad1","Vip","Chat","Sst","Lhx6","Pvalb","Htr3a"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Interneurons") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.plot_cell_clusters(dat, markers=c("Gad2","Pvalb","Sst","Vip","Ndnf","Cck"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Interneurons-Level 1 Markers") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Excitatory markers
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Slc17a6","Slc17a7","Rorb","Ctgf"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Pyramidals") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.plot_cell_clusters(dat, markers=c("Pantr1","Cux2","Satb2"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Upper layers") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.plot_cell_clusters(dat, markers=c("Cdh13","Ctgf","Tle4","Bcl11b"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Deep layers") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.plot_cell_clusters(dat, markers=c("Cux2","Nr5a1","Scnn1a","Tg3","Rorb","Tg2","Rbp4","Ntsr1","Ctgf","Cdh13","Chrna6"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Excitatory - Rough Laminar Markers") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.plot_cell_clusters(dat, markers=c("Sla","S100a3","Macc1","Olfr78","Wfdc18","Wfdc17","Aldh1a7","Oprk1","Rgs8","Htr2c","Hpgd","Sdc1","Trh","Cpa6","Ppp1r18","Fam150a","F2r","P2ry12","Mup3"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Excitatory - ALM Excitatory markers Economo et al") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Brain Fibroblasts
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Lum","Col1a1","Lama1","Efemp1","Dcn","Col6a1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Brain Fibroblasts") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Vascular endothelium
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Vwf","Kit","Flt1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Vascular Endothelium") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Vascular Smooth muscle
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Bgn"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Vascular Smooth Muscle") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Astrocytes
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Gfap","Slc1a3","Aqp4"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Astrocytes") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Neural progenitors
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Fabp7","Pax6","Sox2","Hes5","Nes","Eomes","Id2","Msi1","Sox1","Igfbpl1","Riiad1","Top2a","Ascl1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Neural Progenitors") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Oligodendrocytes
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Mbp","Mobp","Pdgfra","Bmp4","Tmem2"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Oligodendrocytes") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Microglia
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Ctss"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Microglia") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Erythrocytes
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Hbb-bt","Hbb-bs","Hba-x","Hba-a1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Erythrocytes")## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.dev.off()## quartz_off_screen
## 2pdf("figures/excitatory_subtype_markers.pdf",width=40,height=40)
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Ngb","Otof","Sparcl1","Scnn1a","Arf5","Hsd11b1","Fam5c","Syt17","Batf3","Ucma","Samd3","Cdh13","Chrna6","Mgp","Plcxd3","Car12","Trh","Mup5"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Excitatory Subtype Markers") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.dev.off()## quartz_off_screen
## 2Cluster-specific marker genes
Similar to differential expression, we can identify ‘marker genes’ for individual clusters. We can do this using Moran’s I test for spatial autocorrelation in the 2D UMAP embedding. First we must learn the relationship between cells in the UMAP embedding. We do this by learning a principal graph structure and identify genes with .
#Takes ~45 min to run...
start <- Sys.time()
spatial_res <- principalGraphTest(dat[expressed_genes,], relative_expr = TRUE, k = 10, cores = 6,verbose=TRUE)## retrieve the matrices for Moran's test...## Performing Moran's test: ...##
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| | 0%, ETA NA
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| | 0%, ETA 01:24:01
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| | 0%, ETA 01:04:28
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| | 0%, ETA 51:53
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| | 0%, ETA 47:58
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| | 0%, ETA 48:27
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| | 0%, ETA 49:10
|
| | 0%, ETA 48:56
|
| | 0%, ETA 50:44
|
| | 1%, ETA 47:27
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| | 1%, ETA 52:28
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| | 1%, ETA 55:24
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|
| | 1%, ETA 55:50
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| | 1%, ETA 56:29
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| | 1%, ETA 56:52
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| | 1%, ETA 57:12
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| | 1%, ETA 57:17
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|= | 1%, ETA 56:07
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|
|= | 1%, ETA 57:34
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|= | 1%, ETA 57:26
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|= | 1%, ETA 58:28
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|= | 1%, ETA 58:56
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|
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|
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|
|= | 2%, ETA 58:18
|
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|
|= | 2%, ETA 56:52
|
|= | 2%, ETA 56:16
|
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|
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|
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|
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|=== | 6%, ETA 44:42
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|
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|
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|
|==== | 7%, ETA 43:08
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|
|==== | 7%, ETA 43:30
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|
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|
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|=======================================================| 100%, ETA 00:12
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|=======================================================| 100%, ETA 00:11
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|=======================================================| 100%, ETA 00:09
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|=======================================================| 100%, ETA 00:08
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|=======================================================| 100%, ETA 00:07
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|=======================================================| 100%, ETA 00:06
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|=======================================================| 100%, ETA 00:05
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|=======================================================| 100%, ETA 00:03
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|=======================================================| 100%, ETA 00:02
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|=======================================================| 100%, ETA 00:01
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|=======================================================| 100%, ETA 00:00## returning results: ...end <- Sys.time()
end - start## Time difference of 41.01174 minsThen we can calculate the specificity score for each gene \(S_{g,i}=1-\sqrt{H(\frac{\sum_{1}^{n} p_g q_i}{n}) - \sum_{1}^{n} \frac{H(p_g q_i)}{n}}\)
system.time(cluster_marker_res <-
find_cluster_markers(dat[expressed_genes,],
spatial_res,
group_by = 'Cluster',
morans_I_threshold = 0.25,
verbose=TRUE))## user system elapsed
## 11.409 1.910 13.510Now we can take a look a the the genes that are most specific for each of the annotated clusters. This will help us with identifying cell types.
genes <- (cluster_marker_res %>%
dplyr::filter(mean > 0.5, percentage > 0.1) %>%
dplyr::group_by(Group) %>% dplyr::slice(which.max(specificity)))
options(repr.plot.width=22, repr.plot.height=12)
plot_markers_by_group(dat[expressed_genes,], genes$gene_short_name, group_by = 'Cluster', ordering_type = 'maximal_on_diag')## Warning in if (axis_order == "marker_group") {: the condition has length >
## 1 and only the first element will be used
We can also show the expression level for a set of genes in UMAP space as well. For example, we can view a few highly specific genes for a given expression ‘Group’:
genes <-
(cluster_marker_res %>%
dplyr::filter(mean > 0.5, percentage > 0.1) %>%
dplyr::group_by(Group) %>%
dplyr::top_n(5, wt = specificity))
myGroup<-8
n<-4
top_n_genes <- genes %>%
dplyr::filter(Group == myGroup) %>%
dplyr::top_n(n = n, wt = specificity)
top_n_genes## # A tibble: 4 x 16
## # Groups: Group [1]
## Group Gene gene_short_name specificity morans_I morans_test_sta… pval
## <fct> <chr> <chr> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl>
## 1 8 ENSM… Pdgfra 0.686 0.630 111. 0
## 2 8 ENSM… Rlbp1 0.655 0.375 66.0 0
## 3 8 ENSM… Olig2 0.632 0.619 109. 0
## 4 8 ENSM… C1ql1 0.628 0.669 118. 0
## # … with 9 more variables: qval <dbl>, mean <dbl>,
## # num_cells_expressed_in_group <int>, percentage <dbl>, status <fct>,
## # gene_id <chr>, num_cells_expressed <int>, mean_cpc <dbl>,
## # use_for_ordering <lgl>These genes suggest that this group (8) may contain predominantly oligodendrocytes.
marker_genes <- top_n_genes$gene_short_name
plot_cell_clusters(dat,
markers = as.character(marker_genes),
show_group_id = T, cell_size = 0.1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
Major cell type annotation
#These will have to be manually assigned after each new clustering solution
plot_cell_clusters(dat,color="Cluster", cell_size=cell_size, show_group_id = T) + guides(color=FALSE) + coord_equal(1)
pData(dat)$CellType<-"Unknown"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(8,16)] <- "Oligodendrocyte"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(7)] <- "Astrocyte/Radial Glia"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(5,10,14,18)] <- "Interneurons"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(1,2,3,4,6)] <- "Excitatory Neurons"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(13)] <- "Microglia"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(11)] <- "Vascular Endothelium"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(17)] <- "Vascular Smooth Muscle"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c()] <- "Cycling Neural Progenitor"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(12)] <- "Brain Fibroblasts"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c()] <- "Doublets"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(15)] <- "RBCs"
colorCount <- length(unique(pData(dat)$CellType))
getPalette <- colorRampPalette(brewer.pal(9, "Set1"))
p<-plot_cell_clusters(dat,color="CellType",cell_size=0.8, show_group_id = TRUE) + scale_color_manual(values=getPalette(colorCount)) + coord_equal(1)
p
#Save to .pdf
pdf("figures/Major_celltype.pdf",width=12,height=8)
p
dev.off()## quartz_off_screen
## 2Recursive analysis and annotation of sub-celltypes
- Different major cell types have different degrees of heterogeneity
- interneuron subtypes appear quite distinct
- several ‘types’ of pyramidals blend together
- Neural progenitors and Oligos (at P6) appear to be drawn out in a linear fashion
Differential Testing
#Takes ~6-8 minutes to run...
system.time(CellType_DE_genes<-differentialGeneTest(dat[expressed_genes],fullModelFormulaStr = "~num_genes_expressed+CellType",reducedModelFormulaStr = "~num_genes_expressed",cores=6,verbose=TRUE))## user system elapsed
## 19.428 5.819 409.118sigCutoff<-1.0e-9
CellType_sigGeneIDs<-rownames(CellType_DE_genes[CellType_DE_genes$qval<=sigCutoff,])
CellType_sigGenes<-CellType_DE_genes[CellType_DE_genes$qval<=sigCutoff,"gene_short_name"]
length(CellType_sigGenes)## [1] 7102#pdf("figures/CellType_sigGenes_jitter_by_cluster.pdf",width=10,height=5)
#gene_logfc_easy_jitter(dat,CellType_sigGenes, celltypes = unique(pData(dat)$CellType))
#dev.off()Below is a table of all significantly differentially expressed genes between major CellTypes.
sigTable<-CellType_DE_genes[order(CellType_DE_genes$qval,decreasing=FALSE),]
DT::datatable(sigTable[sigTable$qval <= sigCutoff,])## Warning in instance$preRenderHook(instance): It seems your data is too
## big for client-side DataTables. You may consider server-side processing:
## https://rstudio.github.io/DT/server.htmlPattern Discovery (NMF)
nPatterns<-30
# Takes about ~3-4 minutes...
system.time(dat.nnmf<-nnmf(as.matrix(log10(exprs(dat)[expressed_genes,]+1)), k = nPatterns, alpha = rep(0,3), beta = rep(0,3), method = c("scd"), loss = c("mse"),
init = NULL, mask = NULL, W.norm = -1L, check.k = TRUE, max.iter = 500L, rel.tol = 1e-4,
n.threads = 6, trace = 10, verbose = TRUE, show.warning = TRUE))## user system elapsed
## 394.608 21.899 149.223# Gene x Pattern matrix
dim(dat.nnmf$W)## [1] 14241 30# Pattern x Cell matrix
dim(dat.nnmf$H)## [1] 30 5537#Add patterns to phenotype data for visualization
patterns.df<-data.frame(t(dat.nnmf$H))
colnames(patterns.df)<-paste0("Pattern_",c(1:nPatterns))
pData(dat)<-cbind(pData(dat),patterns.df)
pdf("figures/patterns.pdf",width=10,height=10)
lapply(c(1:nPatterns),function(i){
plot_cell_clusters(dat, color=paste0("Pattern_",i), cell_size=cell_size) +
ggtitle(paste0("Pattern_",i)) +
scale_colour_viridis() +
coord_equal(1)
})## [[1]]##
## [[2]]##
## [[3]]##
## [[4]]##
## [[5]]##
## [[6]]##
## [[7]]##
## [[8]]##
## [[9]]##
## [[10]]##
## [[11]]##
## [[12]]##
## [[13]]##
## [[14]]##
## [[15]]##
## [[16]]##
## [[17]]##
## [[18]]##
## [[19]]##
## [[20]]##
## [[21]]##
## [[22]]##
## [[23]]##
## [[24]]##
## [[25]]##
## [[26]]##
## [[27]]##
## [[28]]##
## [[29]]##
## [[30]]dev.off()## quartz_off_screen
## 2Genes associated with learned patterns
geneWeights.df<-data.frame(dat.nnmf$W)
colnames(geneWeights.df)<-paste0("Pattern_",c(1:nPatterns))
#fData(dat)[head(rownames(dat.nnmf$W)[order(dat.nnmf$W[,patternOfInterest],decreasing=TRUE)]),]
tmp<-merge(fData(dat)[,c("gene_id","gene_short_name")],geneWeights.df,by=0)
DT::datatable(tmp[,-1])## Warning in instance$preRenderHook(instance): It seems your data is too
## big for client-side DataTables. You may consider server-side processing:
## https://rstudio.github.io/DT/server.htmlLets see how these patterns learned directly from the data correlate with annotated features
featuresOfInterest<-c("library_id","Genotype","Sex","num_genes_expressed","CellType")
phenoMat<-pData(dat)[,featuresOfInterest]
phenoMat$library_id<-as.numeric(phenoMat$library_id)
phenoMat$Genotype<-as.numeric(factor(phenoMat$Genotype))
phenoMat$Sex<-as.numeric(factor(phenoMat$Sex))
phenoMat$CellType<-as.numeric(factor(phenoMat$CellType))
for (a in levels(pData(dat)$library_id)){
phenoMat[[paste("library_",a,sep="")]]<-as.numeric(factor(pData(dat)$library_id)==a)
}
for (a in levels(pData(dat)$Genotype)){
phenoMat[[a]]<-as.numeric(pData(dat)$Genotype==a)
}
for (a in levels(pData(dat)$Sex)){
phenoMat[[a]]<-as.numeric(pData(dat)$Sex==a)
}
for (a in levels(factor(pData(dat)$CellType))){
phenoMat[[a]]<-as.numeric(pData(dat)$CellType==a)
}
patternPhenoCor<-cor(phenoMat,patterns.df,method="spearman")
#phenoCorTest<-cor.test(phenoMat,dat.pca$x)
patternPhenoCor.melt<-melt(patternPhenoCor)
patternPhenoCor.melt$class<-"Other"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% paste("library_",levels(factor(pData(dat)$library_id)),sep="")]<-"library"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% levels(factor(pData(dat)$CellType))]<-"Cell Type"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% levels(factor(pData(dat)$Genotype))]<-"Genotype"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% levels(factor(pData(dat)$Sex))]<-"Sex"
#col.order<-order.dendrogram(as.dendrogram(hclust(dist(t(patternPhenoCor)))))
col.order<-order.dendrogram(as.dendrogram(hclust(dist(t(patternPhenoCor[rownames(patternPhenoCor) %in% levels(factor(pData(dat)$CellType)),])))))
row.order<-order.dendrogram(as.dendrogram(hclust(dist(patternPhenoCor))))
patternPhenoCor.melt$Var2<-factor(patternPhenoCor.melt$Var2,levels=colnames(patternPhenoCor)[col.order])
patternPhenoCor.melt$Var1<-factor(patternPhenoCor.melt$Var1,levels=rownames(patternPhenoCor)[row.order])
p<-ggplot(patternPhenoCor.melt)
p<- p + geom_tile(aes(x=Var2,y=Var1,fill=value)) +
scale_fill_gradient2(low="steelblue",mid="white",high="tomato") +
theme(axis.text.x=element_text(angle=-90)) +
ggtitle("Pattern:Phenotype Correlation") + xlab("Pattern") + ylab("Feature") +
coord_equal()
p
#pdf(paste0("projections/cut",cut,"/Projected_pattern_pheno_correlations.pdf"),width=30,height=15)
#p + theme(axis.text.x=element_text(angle=-45, hjust=0))
#dev.off()sessionInfo()## R version 3.5.1 (2018-07-02)
## Platform: x86_64-apple-darwin15.6.0 (64-bit)
## Running under: macOS 10.14
##
## Matrix products: default
## BLAS: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/3.5/Resources/lib/libRblas.0.dylib
## LAPACK: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/3.5/Resources/lib/libRlapack.dylib
##
## locale:
## [1] en_US.UTF-8/en_US.UTF-8/en_US.UTF-8/C/en_US.UTF-8/en_US.UTF-8
##
## attached base packages:
## [1] splines stats4 parallel stats graphics grDevices utils
## [8] datasets methods base
##
## other attached packages:
## [1] L1Graph_0.1.1 lpSolveAPI_5.5.2.0-17 bindrcpp_0.2.2
## [4] ggrastr_0.1.7 DT_0.5 reshape2_1.4.3
## [7] viridis_0.5.1 viridisLite_0.3.0 NNLM_0.4.2
## [10] dplyr_0.7.7 gridExtra_2.3 pheatmap_1.0.10
## [13] VGAM_1.0-5 reticulate_1.10 monocle_2.99.1
## [16] DDRTree_0.1.5 irlba_2.3.2 igraph_1.2.2
## [19] DelayedArray_0.6.6 BiocParallel_1.14.2 IRanges_2.14.12
## [22] S4Vectors_0.18.3 matrixStats_0.54.0 stringr_1.4.0
## [25] cellrangerRkit_2.0.0 Rmisc_1.5 plyr_1.8.4
## [28] lattice_0.20-35 bit64_0.9-7 bit_1.1-14
## [31] ggplot2_3.1.0 RColorBrewer_1.1-2 Biobase_2.40.0
## [34] BiocGenerics_0.26.0 Matrix_1.2-14
##
## loaded via a namespace (and not attached):
## [1] Rtsne_0.13 colorspace_1.4-0
## [3] deldir_0.1-15 ggridges_0.5.1
## [5] rprojroot_1.3-2 listenv_0.7.0
## [7] ggrepel_0.8.0 fansi_0.4.0
## [9] codetools_0.2-15 docopt_0.6.1
## [11] doParallel_1.0.14 knitr_1.20
## [13] jsonlite_1.5 cluster_2.0.7-1
## [15] shiny_1.1.0 compiler_3.5.1
## [17] backports_1.1.2 assertthat_0.2.0
## [19] lazyeval_0.2.1 cli_1.0.1
## [21] limma_3.36.5 later_0.7.5
## [23] htmltools_0.3.6 tools_3.5.1
## [25] coda_0.19-2 gtable_0.2.0
## [27] glue_1.3.0 RANN_2.6
## [29] gmodels_2.18.1 Rcpp_1.0.0
## [31] slam_0.1-43 spdep_0.7-9
## [33] gdata_2.18.0 nlme_3.1-137
## [35] DelayedMatrixStats_1.2.0 iterators_1.0.10
## [37] crosstalk_1.0.0 globals_0.12.4
## [39] mime_0.6 miniUI_0.1.1.1
## [41] gtools_3.8.1 future_1.10.0
## [43] LearnBayes_2.15.1 MASS_7.3-51
## [45] scales_1.0.0 promises_1.0.1
## [47] rhdf5_2.24.0 expm_0.999-3
## [49] yaml_2.2.0 pbapply_1.3-4
## [51] fastICA_1.2-1 stringi_1.3.1
## [53] foreach_1.4.4 densityClust_0.3
## [55] boot_1.3-20 manipulateWidget_0.10.0
## [57] spData_0.2.9.4 rlang_0.3.1
## [59] pkgconfig_2.0.2 rgl_0.99.16
## [61] qlcMatrix_0.9.7 evaluate_0.12
## [63] purrr_0.2.5 Rhdf5lib_1.2.1
## [65] bindr_0.1.1 labeling_0.3
## [67] htmlwidgets_1.3 tidyselect_0.2.5
## [69] magrittr_1.5 R6_2.4.0
## [71] pillar_1.3.1 withr_2.1.2
## [73] sp_1.3-1 tibble_2.0.1
## [75] crayon_1.3.4 utf8_1.1.4
## [77] rmarkdown_1.10 grid_3.5.1
## [79] data.table_1.11.8 FNN_1.1.2.1
## [81] HSMMSingleCell_0.114.0 sparsesvd_0.1-4
## [83] digest_0.6.18 webshot_0.5.1
## [85] pbmcapply_1.2.5 xtable_1.8-3
## [87] httpuv_1.4.5 munsell_0.5.0
## [89] glmnet_2.0-16