This tutorial assumes that we have already performed the initial preprocessing of the data using the cellRanger pipeline from 10x Genomics. One of the end results of this preprocessing is a genes X cells matrix of Unique Molecular Identifier (UMI) counts. E.g.:
| cell1 | cell2 | cell3 | |
|---|---|---|---|
| gene1 | 0 | 2 | 0 |
| gene2 | 15 | 7 | 3 |
| gene3 | 1 | 0 | 2 |
…
So let’s import the raw count data from the cellRanger output. The key files here are matrix.mtx, barcodes.tsv, and genes.tsv.
cellranger_dir <- 'data/10x/preprocessed'
raw <- load_cellranger_matrix(cellranger_dir)
## Searching for genomes in: data/10x/preprocessed/outs/filtered_gene_bc_matrices_mex
## Using mm10 in folder: data/10x/preprocessed/outs/filtered_gene_bc_matrices_mex/mm10
## Loaded matrix information
## Loaded gene information
## Loaded barcode information
## Could not find summary csv:
## data/10x/preprocessed/outs/metrics_summary.csv.
## This file is only necessary if you are performing depth-normalization (calling the equalize_gbms function) in R.
## If this pipestance was produced by `cellranger aggr` with the default parameters, depth-normalization in R (via equalize_gbms) is not necessary.
#saveRDS(raw,'data/raw.rds')
raw
## GeneBCMatrix (storageMode: environment)
## assayData: 27998 features, 55371 samples
## element names: exprs
## protocolData: none
## phenoData
## sampleNames: AAACCTGAGACACTAA-1 AAACCTGAGACCCACC-1 ...
## TTTGTCATCTCCGGTT-10 (55371 total)
## varLabels: barcode
## varMetadata: labelDescription
## featureData
## featureNames: ENSMUSG00000051951 ENSMUSG00000089699 ...
## ENSMUSG00000095742 (27998 total)
## fvarLabels: id symbol
## fvarMetadata: labelDescription
## experimentData: use 'experimentData(object)'
## Annotation:
We would also like to add a bit of external information about the genes and samples (cells) to help us make some better interpretations downstream.
# Prep for CDS
fd <- fData(raw)
#change default feature column names to Monocle-friendly terms
colnames(fd) <- c("gene_id","gene_short_name")
# Prep for CDS
pd <- pData(raw)
# Extract sample 'number' information from barcode (cell_id) substring
pd$sample_num<-as.numeric(str_sub(pd$barcode, start= 18))
Merge in external annotations
sample_info<-read.csv('data/annotation/sample_aggregation.csv',header=T)
master_sample_sheet<-read.csv('data/annotation/sample_info.csv',header=T)
#Merge cellranger aggr data with external annotation
sample_info<-merge(sample_info,master_sample_sheet,by.x="library_id",by.y="sample_id",sort = FALSE)
#Merge all annotation with pd
pd<-merge(pd,sample_info,by.x='sample_num',by.y=0,sort=F)
rownames(pd)<-pd$barcode
Many R packages for high-throughput sequencing data use a general structure for data organization (Class) derived from the Bioconductor ExpressionSet object. The Monocle package defines the CellDataSet class, which inherits from ExpressionSet, to hold and manipulate single cell RNA-Seq data. The layout of a CDS object is roughly as follows:
Schematic of the Monocle CellDataSet class
Here we create the Monocle CellDataSet object from our imported, cleaned, and annotated data
Create monocle CDS object
dat <- newCellDataSet(exprs(raw),
phenoData = new("AnnotatedDataFrame", data = pd),
featureData = new("AnnotatedDataFrame", data = fd),
lowerDetectionLimit = 0.5,
expressionFamily = negbinomial.size())
dat
## CellDataSet (storageMode: environment)
## assayData: 27998 features, 55371 samples
## element names: exprs
## protocolData: none
## phenoData
## sampleNames: AAACCTGAGACACTAA-1 AAACCTGAGACCCACC-1 ...
## TTTGTCATCTCCGGTT-10 (55371 total)
## varLabels: sample_num barcode ... Size_Factor (26 total)
## varMetadata: labelDescription
## featureData
## featureNames: ENSMUSG00000051951 ENSMUSG00000089699 ...
## ENSMUSG00000095742 (27998 total)
## fvarLabels: gene_id gene_short_name
## fvarMetadata: labelDescription
## experimentData: use 'experimentData(object)'
## Annotation:
For the purposes of this lab, and to allow for things to run in a reasonable timeframe, we are going to reduce the number of cells we will consider randomly by ~ 90%. (This is not normally done, but we won’t get through much in this lab unless we cull).
#sampleFactor<-0.1
#sampleCellBarcodes<-sample(rownames(pData(dat)),dim(dat)[2]*sampleFactor)
#write.csv(sampleCellBarcodes,'data/annotation/sampleCellBarcodes.csv')
sampleCellBarcodes<-read.csv('data/annotation/sampleCellBarcodes.csv',stringsAsFactors = FALSE)$x
dat<-dat[,sampleCellBarcodes]
dat
## CellDataSet (storageMode: environment)
## assayData: 27998 features, 5537 samples
## element names: exprs
## protocolData: none
## phenoData
## sampleNames: ACACCGGTCACTTCAT-10 TCGTAGAAGCTAAACA-6 ...
## GTTACAGAGTGTACTC-4 (5537 total)
## varLabels: sample_num barcode ... Size_Factor (26 total)
## varMetadata: labelDescription
## featureData
## featureNames: ENSMUSG00000051951 ENSMUSG00000089699 ...
## ENSMUSG00000095742 (27998 total)
## fvarLabels: gene_id gene_short_name
## fvarMetadata: labelDescription
## experimentData: use 'experimentData(object)'
## Annotation:
Before we can start to process the data, we first need to get some summary statistics such as a scaling factor and an estimate of the dispersion for each gene (variance in excess of what is expected for a given model fit).
dat<-estimateSizeFactors(dat)
dat<-estimateDispersions(dat,cores=4)
## Processing block 1/1 ... OK
## Warning in log(ifelse(y == 0, 1, y/mu)): NaNs produced
## Warning: step size truncated due to divergence
## Removing 79 outliers
#saveRDS(dat,'data/dat.rds')
It’s a good idea, and saves time/effort to identify and only consider genes whose expression levels are detected in a certain number or proportion of cells within your assay.
dat<-detectGenes(dat)
cellCutoff<-20
expressed_genes <- row.names(subset(fData(dat),
num_cells_expressed >= cellCutoff))
hist(fData(dat)$num_cells_expressed,col="red",breaks=50,main="Number of cells expressing a given gene")
hist(log10(fData(dat)$num_cells_expressed),col="red",breaks=50,main="Number of cells expressing a given gene")
abline(v=log10(cellCutoff),lty="dashed")
We have now identified a total of 14241 that are detectably expressed in at least 20 cells in our dataset.
hist(pData(dat)$num_genes_expressed,col="darkgreen",breaks=50,main="Number of genes expressed per cell")
A high proportion of mitochondrial genes may indicate a lower than ideal capture efficiency for a given cell.
mito_genes<-fData(dat)$gene_id[grepl("^mt-",fData(dat)$gene_short_name)]
pData(dat)$mt_reads <- Matrix::colSums(exprs(dat)[mito_genes,])
pData(dat)$total_reads <- Matrix::colSums(exprs(dat))
pData(dat)$mito_ratio <- pData(dat)$mt_reads/pData(dat)$total_reads
ggplot(pData(dat),
aes(x = num_genes_expressed, y = mito_ratio)) +
geom_point() +
labs(x = "Number of genes", y = "Mitochondrial ratio") +
scale_color_brewer(palette = "Set1") +
theme(legend.position = "none")
fData(dat)$mean_cpc<-Matrix::rowMeans(exprs(dat))
hist(log10(fData(dat[expressed_genes,])$mean_cpc),col="purple",breaks=50)
disp_table = dispersionTable(dat)
disp_table = disp_table %>% mutate(excess_disp =
(dispersion_empirical - dispersion_fit) / dispersion_fit) %>%
arrange(plyr::desc(excess_disp))
expression_cutoff<-1e-04
top_subset_genes = intersect(fData(dat)$gene_id[fData(dat)$mean_cpc>=expression_cutoff],disp_table$gene_id[disp_table$excess_disp>0])
#top_subset_genes = as.character(head(disp_table, 1000)$gene_id)
dat <- setOrderingFilter(dat, top_subset_genes)
plot_ordering_genes(dat)
## Warning: Transformation introduced infinite values in continuous y-axis
To analyze a single-cell dataset, we will next normalize expression values to account for technical variation in RNA recovery across cells and for sequencing depth.
#log-transform and initial PCA
dat <- preprocessCDS(dat, method = 'PCA',
norm_method = 'log',
num_dim = 25, #Arbitrary....I should look at scree plot.
verbose = T)
## Remove noise by PCA ...
## Processing block 1/1 ... OK
A crucial next step is to summarize the set of significant learned principal components into an interpretable set of dimensions (e.g. 2).
#UMAP dimensionality reduction
dat <- reduceDimension(dat, max_components = 2,
reduction_method = 'UMAP',
metric="correlation",
#metric="cosine",
#min_dist = 0.75,
#n_neighbors = 50,
verbose = T
)
## Retrieving normalized data ...
## Running Uniform Manifold Approximation and Projection
Cluster Cells
dat <- clusterCells(dat,
method = 'louvain',
res = 1e-3,
#res = NULL,
louvain_iter = 1,
verbose = T)
## Warning in if (cell_names != row.names(pd)) stop("phenotype and row name
## from the data doesn't match"): the condition has length > 1 and only the
## first element will be used
## Run kNN based graph clustering starts:
## -Input data of 5537 rows and 2 columns
## -k is set to 20
## Finding nearest neighbors...DONE ~ 0.025 s
## Compute jaccard coefficient between nearest-neighbor sets ...DONE ~ 0.003 s
## Build undirected graph from the weighted links ...DONE ~ 0.032 s
## Run louvain clustering on the graph ...
## Running louvain iteration 1 ...
## Current iteration is 1; current resolution is 0.001; Modularity is 0.900082750362549; Number of clusters are 19
## Maximal modularity is 0.900082750362549; corresponding resolution is 0.001
##
## Run kNN based graph clustering DONE, totally takes 0.335412979125977 s.
## -Number of clusters: 19
cell_size<-0.2
pdf("figures/initial_clustering.pdf")
plot_cell_clusters(dat,color="Cluster", cell_size=cell_size, show_group_id = T) + guides(color=FALSE) + coord_equal(1)
plot_cell_clusters(dat,color="Genotype", cell_size=cell_size) + scale_color_manual(values=c("red","grey40"))
plot_cell_clusters(dat,color="Sex", cell_size=cell_size) + scale_color_manual(values=c("orange","darkblue"))
plot_cell_clusters(dat,color="library_id", cell_size=cell_size)
dev.off()
## quartz_off_screen
## 2
Some (not all) of the markers came from here http://casestudies.brain-map.org/celltax
pdf("figures/Markers.pdf",width=15,height=15)
#Interneuron markers
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Gad1","Vip","Chat","Sst","Lhx6","Pvalb","Htr3a"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Interneurons") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Gad2","Pvalb","Sst","Vip","Ndnf","Cck"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Interneurons-Level 1 Markers") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
# Excitatory markers
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Slc17a6","Slc17a7","Rorb","Ctgf"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Pyramidals") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Pantr1","Cux2","Satb2"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Upper layers") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Cdh13","Ctgf","Tle4","Bcl11b"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Deep layers") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Cux2","Nr5a1","Scnn1a","Tg3","Rorb","Tg2","Rbp4","Ntsr1","Ctgf","Cdh13","Chrna6"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Excitatory - Rough Laminar Markers") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Sla","S100a3","Macc1","Olfr78","Wfdc18","Wfdc17","Aldh1a7","Oprk1","Rgs8","Htr2c","Hpgd","Sdc1","Trh","Cpa6","Ppp1r18","Fam150a","F2r","P2ry12","Mup3"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Excitatory - ALM Excitatory markers Economo et al") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
# Brain Fibroblasts
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Lum","Col1a1","Lama1","Efemp1","Dcn","Col6a1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Brain Fibroblasts") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
# Vascular endothelium
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Vwf","Kit","Flt1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Vascular Endothelium") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
# Vascular Smooth muscle
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Bgn"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Vascular Smooth Muscle") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
# Astrocytes
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Gfap","Slc1a3","Aqp4"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Astrocytes") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
# Neural progenitors
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Fabp7","Pax6","Sox2","Hes5","Nes","Eomes","Id2","Msi1","Sox1","Igfbpl1","Riiad1","Top2a","Ascl1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Neural Progenitors") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
# Oligodendrocytes
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Mbp","Mobp","Pdgfra","Bmp4","Tmem2"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Oligodendrocytes") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
# Microglia
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Ctss"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Microglia") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
# Erythrocytes
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Hbb-bt","Hbb-bs","Hba-x","Hba-a1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Erythrocytes")
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
dev.off()
## quartz_off_screen
## 2
pdf("figures/excitatory_subtype_markers.pdf",width=40,height=40)
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Ngb","Otof","Sparcl1","Scnn1a","Arf5","Hsd11b1","Fam5c","Syt17","Batf3","Ucma","Samd3","Cdh13","Chrna6","Mgp","Plcxd3","Car12","Trh","Mup5"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Excitatory Subtype Markers") + coord_equal(1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
dev.off()
## quartz_off_screen
## 2
Similar to differential expression, we can identify ‘marker genes’ for individual clusters. We can do this using Moran’s I test for spatial autocorrelation in the 2D UMAP embedding. First we must learn the relationship between cells in the UMAP embedding. We do this by learning a principal graph structure and identify genes with .
#Takes ~45 min to run...
start <- Sys.time()
spatial_res <- principalGraphTest(dat[expressed_genes,], relative_expr = TRUE, k = 10, cores = 6,verbose=TRUE)
## retrieve the matrices for Moran's test...
## Performing Moran's test: ...
##
|
| | 0%, ETA NA
|
| | 0%, ETA 05:29:54
|
| | 0%, ETA 01:24:01
|
| | 0%, ETA 01:04:28
|
| | 0%, ETA 57:19
|
| | 0%, ETA 53:52
|
| | 0%, ETA 51:53
|
| | 0%, ETA 50:19
|
| | 0%, ETA 47:58
|
| | 0%, ETA 48:27
|
| | 0%, ETA 49:10
|
| | 0%, ETA 48:56
|
| | 0%, ETA 50:44
|
| | 1%, ETA 47:27
|
| | 1%, ETA 52:28
|
| | 1%, ETA 53:58
|
| | 1%, ETA 55:12
|
| | 1%, ETA 55:24
|
| | 1%, ETA 56:16
|
| | 1%, ETA 55:50
|
| | 1%, ETA 56:29
|
| | 1%, ETA 56:52
|
| | 1%, ETA 57:12
|
| | 1%, ETA 57:17
|
|= | 1%, ETA 56:07
|
|= | 1%, ETA 57:43
|
|= | 1%, ETA 57:34
|
|= | 1%, ETA 57:26
|
|= | 1%, ETA 57:48
|
|= | 1%, ETA 58:00
|
|= | 1%, ETA 58:28
|
|= | 1%, ETA 58:56
|
|= | 1%, ETA 59:29
|
|= | 1%, ETA 01:02:44
|
|= | 1%, ETA 01:01:37
|
|= | 1%, ETA 01:00:18
|
|= | 1%, ETA 59:07
|
|= | 1%, ETA 58:55
|
|= | 2%, ETA 58:18
|
|= | 2%, ETA 57:33
|
|= | 2%, ETA 56:52
|
|= | 2%, ETA 56:16
|
|= | 2%, ETA 55:49
|
|= | 2%, ETA 55:15
|
|= | 2%, ETA 54:51
|
|= | 2%, ETA 54:28
|
|= | 2%, ETA 53:54
|
|= | 2%, ETA 53:18
|
|= | 2%, ETA 52:37
|
|= | 2%, ETA 52:08
|
|= | 2%, ETA 52:06
|
|= | 2%, ETA 52:10
|
|= | 2%, ETA 52:17
|
|= | 2%, ETA 52:11
|
|= | 2%, ETA 51:59
|
|= | 2%, ETA 52:03
|
|= | 2%, ETA 52:19
|
|= | 2%, ETA 52:29
|
|= | 2%, ETA 52:37
|
|= | 2%, ETA 52:49
|
|= | 3%, ETA 52:11
|
|= | 3%, ETA 52:56
|
|= | 3%, ETA 53:30
|
|= | 3%, ETA 53:11
|
|= | 3%, ETA 52:30
|
|== | 3%, ETA 52:02
|
|== | 3%, ETA 51:30
|
|== | 3%, ETA 50:47
|
|== | 3%, ETA 50:29
|
|== | 3%, ETA 50:32
|
|== | 3%, ETA 49:46
|
|== | 3%, ETA 49:49
|
|== | 3%, ETA 49:18
|
|== | 3%, ETA 48:55
|
|== | 3%, ETA 48:59
|
|== | 3%, ETA 48:19
|
|== | 3%, ETA 48:39
|
|== | 3%, ETA 48:46
|
|== | 3%, ETA 48:59
|
|== | 4%, ETA 48:41
|
|== | 4%, ETA 49:06
|
|== | 4%, ETA 49:09
|
|== | 4%, ETA 49:19
|
|== | 4%, ETA 49:25
|
|== | 4%, ETA 49:33
|
|== | 4%, ETA 49:40
|
|== | 4%, ETA 49:53
|
|== | 4%, ETA 49:55
|
|== | 4%, ETA 49:27
|
|== | 4%, ETA 49:14
|
|== | 4%, ETA 48:46
|
|== | 4%, ETA 48:38
|
|== | 4%, ETA 48:12
|
|== | 4%, ETA 48:05
|
|== | 4%, ETA 47:42
|
|== | 4%, ETA 47:36
|
|== | 4%, ETA 47:13
|
|== | 4%, ETA 47:10
|
|== | 4%, ETA 46:47
|
|== | 5%, ETA 46:53
|
|=== | 5%, ETA 46:41
|
|=== | 5%, ETA 46:23
|
|=== | 5%, ETA 46:29
|
|=== | 5%, ETA 46:32
|
|=== | 5%, ETA 46:52
|
|=== | 5%, ETA 46:54
|
|=== | 5%, ETA 47:01
|
|=== | 5%, ETA 47:08
|
|=== | 5%, ETA 47:08
|
|=== | 5%, ETA 47:02
|
|=== | 5%, ETA 47:09
|
|=== | 5%, ETA 47:04
|
|=== | 5%, ETA 46:51
|
|=== | 5%, ETA 46:38
|
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|
|=== | 5%, ETA 46:13
|
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|
|=== | 5%, ETA 45:50
|
|=== | 5%, ETA 45:43
|
|=== | 5%, ETA 45:25
|
|=== | 6%, ETA 45:18
|
|=== | 6%, ETA 45:13
|
|=== | 6%, ETA 45:08
|
|=== | 6%, ETA 44:52
|
|=== | 6%, ETA 44:46
|
|=== | 6%, ETA 44:42
|
|=== | 6%, ETA 44:28
|
|=== | 6%, ETA 44:42
|
|=== | 6%, ETA 44:46
|
|=== | 6%, ETA 44:47
|
|=== | 6%, ETA 44:50
|
|=== | 6%, ETA 45:05
|
|=== | 6%, ETA 44:54
|
|=== | 6%, ETA 44:58
|
|=== | 6%, ETA 44:54
|
|=== | 6%, ETA 44:46
|
|=== | 6%, ETA 44:26
|
|=== | 6%, ETA 44:27
|
|==== | 6%, ETA 44:21
|
|==== | 6%, ETA 44:05
|
|==== | 6%, ETA 44:03
|
|==== | 7%, ETA 44:01
|
|==== | 7%, ETA 43:48
|
|==== | 7%, ETA 43:46
|
|==== | 7%, ETA 43:36
|
|==== | 7%, ETA 43:24
|
|==== | 7%, ETA 43:24
|
|==== | 7%, ETA 43:18
|
|==== | 7%, ETA 43:08
|
|==== | 7%, ETA 43:08
|
|==== | 7%, ETA 43:18
|
|==== | 7%, ETA 43:24
|
|==== | 7%, ETA 43:28
|
|==== | 7%, ETA 43:30
|
|==== | 7%, ETA 43:30
|
|==== | 7%, ETA 43:39
|
|==== | 7%, ETA 43:35
|
|==== | 7%, ETA 43:22
|
|==== | 7%, ETA 43:11
|
|==== | 7%, ETA 43:02
|
|==== | 7%, ETA 43:00
|
|==== | 8%, ETA 42:58
|
|==== | 8%, ETA 42:53
|
|==== | 8%, ETA 42:45
|
|==== | 8%, ETA 42:40
|
|==== | 8%, ETA 42:34
|
|==== | 8%, ETA 42:26
|
|==== | 8%, ETA 42:21
|
|==== | 8%, ETA 42:16
|
|==== | 8%, ETA 42:09
|
|==== | 8%, ETA 42:04
|
|==== | 8%, ETA 41:58
|
|==== | 8%, ETA 41:52
|
|==== | 8%, ETA 41:57
|
|===== | 8%, ETA 42:04
|
|===== | 8%, ETA 42:12
|
|===== | 8%, ETA 42:17
|
|===== | 8%, ETA 42:22
|
|===== | 8%, ETA 42:27
|
|===== | 8%, ETA 42:29
|
|===== | 8%, ETA 42:30
|
|===== | 8%, ETA 42:31
|
|===== | 9%, ETA 42:33
|
|===== | 9%, ETA 42:26
|
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|=======================================================| 99%, ETA 00:13
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|=======================================================| 100%, ETA 00:01
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|=======================================================| 100%, ETA 00:00
## returning results: ...
end <- Sys.time()
end - start
## Time difference of 41.01174 mins
Then we can calculate the specificity score for each gene \(S_{g,i}=1-\sqrt{H(\frac{\sum_{1}^{n} p_g q_i}{n}) - \sum_{1}^{n} \frac{H(p_g q_i)}{n}}\)
system.time(cluster_marker_res <-
find_cluster_markers(dat[expressed_genes,],
spatial_res,
group_by = 'Cluster',
morans_I_threshold = 0.25,
verbose=TRUE))
## user system elapsed
## 11.409 1.910 13.510
Now we can take a look a the the genes that are most specific for each of the annotated clusters. This will help us with identifying cell types.
genes <- (cluster_marker_res %>%
dplyr::filter(mean > 0.5, percentage > 0.1) %>%
dplyr::group_by(Group) %>% dplyr::slice(which.max(specificity)))
options(repr.plot.width=22, repr.plot.height=12)
plot_markers_by_group(dat[expressed_genes,], genes$gene_short_name, group_by = 'Cluster', ordering_type = 'maximal_on_diag')
## Warning in if (axis_order == "marker_group") {: the condition has length >
## 1 and only the first element will be used
We can also show the expression level for a set of genes in UMAP space as well. For example, we can view a few highly specific genes for a given expression ‘Group’:
genes <-
(cluster_marker_res %>%
dplyr::filter(mean > 0.5, percentage > 0.1) %>%
dplyr::group_by(Group) %>%
dplyr::top_n(5, wt = specificity))
myGroup<-8
n<-4
top_n_genes <- genes %>%
dplyr::filter(Group == myGroup) %>%
dplyr::top_n(n = n, wt = specificity)
top_n_genes
## # A tibble: 4 x 16
## # Groups: Group [1]
## Group Gene gene_short_name specificity morans_I morans_test_sta… pval
## <fct> <chr> <chr> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl>
## 1 8 ENSM… Pdgfra 0.686 0.630 111. 0
## 2 8 ENSM… Rlbp1 0.655 0.375 66.0 0
## 3 8 ENSM… Olig2 0.632 0.619 109. 0
## 4 8 ENSM… C1ql1 0.628 0.669 118. 0
## # … with 9 more variables: qval <dbl>, mean <dbl>,
## # num_cells_expressed_in_group <int>, percentage <dbl>, status <fct>,
## # gene_id <chr>, num_cells_expressed <int>, mean_cpc <dbl>,
## # use_for_ordering <lgl>
These genes suggest that this group (8) may contain predominantly oligodendrocytes.
marker_genes <- top_n_genes$gene_short_name
plot_cell_clusters(dat,
markers = as.character(marker_genes),
show_group_id = T, cell_size = 0.1)
## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
#These will have to be manually assigned after each new clustering solution
plot_cell_clusters(dat,color="Cluster", cell_size=cell_size, show_group_id = T) + guides(color=FALSE) + coord_equal(1)
pData(dat)$CellType<-"Unknown"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(8,16)] <- "Oligodendrocyte"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(7)] <- "Astrocyte/Radial Glia"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(5,10,14,18)] <- "Interneurons"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(1,2,3,4,6)] <- "Excitatory Neurons"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(13)] <- "Microglia"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(11)] <- "Vascular Endothelium"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(17)] <- "Vascular Smooth Muscle"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c()] <- "Cycling Neural Progenitor"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(12)] <- "Brain Fibroblasts"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c()] <- "Doublets"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(15)] <- "RBCs"
colorCount <- length(unique(pData(dat)$CellType))
getPalette <- colorRampPalette(brewer.pal(9, "Set1"))
p<-plot_cell_clusters(dat,color="CellType",cell_size=0.8, show_group_id = TRUE) + scale_color_manual(values=getPalette(colorCount)) + coord_equal(1)
p
#Save to .pdf
pdf("figures/Major_celltype.pdf",width=12,height=8)
p
dev.off()
## quartz_off_screen
## 2
#Takes ~6-8 minutes to run...
system.time(CellType_DE_genes<-differentialGeneTest(dat[expressed_genes],fullModelFormulaStr = "~num_genes_expressed+CellType",reducedModelFormulaStr = "~num_genes_expressed",cores=6,verbose=TRUE))
## user system elapsed
## 19.428 5.819 409.118
sigCutoff<-1.0e-9
CellType_sigGeneIDs<-rownames(CellType_DE_genes[CellType_DE_genes$qval<=sigCutoff,])
CellType_sigGenes<-CellType_DE_genes[CellType_DE_genes$qval<=sigCutoff,"gene_short_name"]
length(CellType_sigGenes)
## [1] 7102
#pdf("figures/CellType_sigGenes_jitter_by_cluster.pdf",width=10,height=5)
#gene_logfc_easy_jitter(dat,CellType_sigGenes, celltypes = unique(pData(dat)$CellType))
#dev.off()
Below is a table of all significantly differentially expressed genes between major CellTypes.
sigTable<-CellType_DE_genes[order(CellType_DE_genes$qval,decreasing=FALSE),]
DT::datatable(sigTable[sigTable$qval <= sigCutoff,])
## Warning in instance$preRenderHook(instance): It seems your data is too
## big for client-side DataTables. You may consider server-side processing:
## https://rstudio.github.io/DT/server.html
nPatterns<-30
# Takes about ~3-4 minutes...
system.time(dat.nnmf<-nnmf(as.matrix(log10(exprs(dat)[expressed_genes,]+1)), k = nPatterns, alpha = rep(0,3), beta = rep(0,3), method = c("scd"), loss = c("mse"),
init = NULL, mask = NULL, W.norm = -1L, check.k = TRUE, max.iter = 500L, rel.tol = 1e-4,
n.threads = 6, trace = 10, verbose = TRUE, show.warning = TRUE))
## user system elapsed
## 394.608 21.899 149.223
# Gene x Pattern matrix
dim(dat.nnmf$W)
## [1] 14241 30
# Pattern x Cell matrix
dim(dat.nnmf$H)
## [1] 30 5537
#Add patterns to phenotype data for visualization
patterns.df<-data.frame(t(dat.nnmf$H))
colnames(patterns.df)<-paste0("Pattern_",c(1:nPatterns))
pData(dat)<-cbind(pData(dat),patterns.df)
pdf("figures/patterns.pdf",width=10,height=10)
lapply(c(1:nPatterns),function(i){
plot_cell_clusters(dat, color=paste0("Pattern_",i), cell_size=cell_size) +
ggtitle(paste0("Pattern_",i)) +
scale_colour_viridis() +
coord_equal(1)
})
## [[1]]
##
## [[2]]
##
## [[3]]
##
## [[4]]
##
## [[5]]
##
## [[6]]
##
## [[7]]
##
## [[8]]
##
## [[9]]
##
## [[10]]
##
## [[11]]
##
## [[12]]
##
## [[13]]
##
## [[14]]
##
## [[15]]
##
## [[16]]
##
## [[17]]
##
## [[18]]
##
## [[19]]
##
## [[20]]
##
## [[21]]
##
## [[22]]
##
## [[23]]
##
## [[24]]
##
## [[25]]
##
## [[26]]
##
## [[27]]
##
## [[28]]
##
## [[29]]
##
## [[30]]
dev.off()
## quartz_off_screen
## 2
geneWeights.df<-data.frame(dat.nnmf$W)
colnames(geneWeights.df)<-paste0("Pattern_",c(1:nPatterns))
#fData(dat)[head(rownames(dat.nnmf$W)[order(dat.nnmf$W[,patternOfInterest],decreasing=TRUE)]),]
tmp<-merge(fData(dat)[,c("gene_id","gene_short_name")],geneWeights.df,by=0)
DT::datatable(tmp[,-1])
## Warning in instance$preRenderHook(instance): It seems your data is too
## big for client-side DataTables. You may consider server-side processing:
## https://rstudio.github.io/DT/server.html
Lets see how these patterns learned directly from the data correlate with annotated features
featuresOfInterest<-c("library_id","Genotype","Sex","num_genes_expressed","CellType")
phenoMat<-pData(dat)[,featuresOfInterest]
phenoMat$library_id<-as.numeric(phenoMat$library_id)
phenoMat$Genotype<-as.numeric(factor(phenoMat$Genotype))
phenoMat$Sex<-as.numeric(factor(phenoMat$Sex))
phenoMat$CellType<-as.numeric(factor(phenoMat$CellType))
for (a in levels(pData(dat)$library_id)){
phenoMat[[paste("library_",a,sep="")]]<-as.numeric(factor(pData(dat)$library_id)==a)
}
for (a in levels(pData(dat)$Genotype)){
phenoMat[[a]]<-as.numeric(pData(dat)$Genotype==a)
}
for (a in levels(pData(dat)$Sex)){
phenoMat[[a]]<-as.numeric(pData(dat)$Sex==a)
}
for (a in levels(factor(pData(dat)$CellType))){
phenoMat[[a]]<-as.numeric(pData(dat)$CellType==a)
}
patternPhenoCor<-cor(phenoMat,patterns.df,method="spearman")
#phenoCorTest<-cor.test(phenoMat,dat.pca$x)
patternPhenoCor.melt<-melt(patternPhenoCor)
patternPhenoCor.melt$class<-"Other"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% paste("library_",levels(factor(pData(dat)$library_id)),sep="")]<-"library"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% levels(factor(pData(dat)$CellType))]<-"Cell Type"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% levels(factor(pData(dat)$Genotype))]<-"Genotype"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% levels(factor(pData(dat)$Sex))]<-"Sex"
#col.order<-order.dendrogram(as.dendrogram(hclust(dist(t(patternPhenoCor)))))
col.order<-order.dendrogram(as.dendrogram(hclust(dist(t(patternPhenoCor[rownames(patternPhenoCor) %in% levels(factor(pData(dat)$CellType)),])))))
row.order<-order.dendrogram(as.dendrogram(hclust(dist(patternPhenoCor))))
patternPhenoCor.melt$Var2<-factor(patternPhenoCor.melt$Var2,levels=colnames(patternPhenoCor)[col.order])
patternPhenoCor.melt$Var1<-factor(patternPhenoCor.melt$Var1,levels=rownames(patternPhenoCor)[row.order])
p<-ggplot(patternPhenoCor.melt)
p<- p + geom_tile(aes(x=Var2,y=Var1,fill=value)) +
scale_fill_gradient2(low="steelblue",mid="white",high="tomato") +
theme(axis.text.x=element_text(angle=-90)) +
ggtitle("Pattern:Phenotype Correlation") + xlab("Pattern") + ylab("Feature") +
coord_equal()
p
#pdf(paste0("projections/cut",cut,"/Projected_pattern_pheno_correlations.pdf"),width=30,height=15)
#p + theme(axis.text.x=element_text(angle=-45, hjust=0))
#dev.off()
sessionInfo()
## R version 3.5.1 (2018-07-02)
## Platform: x86_64-apple-darwin15.6.0 (64-bit)
## Running under: macOS 10.14
##
## Matrix products: default
## BLAS: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/3.5/Resources/lib/libRblas.0.dylib
## LAPACK: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/3.5/Resources/lib/libRlapack.dylib
##
## locale:
## [1] en_US.UTF-8/en_US.UTF-8/en_US.UTF-8/C/en_US.UTF-8/en_US.UTF-8
##
## attached base packages:
## [1] splines stats4 parallel stats graphics grDevices utils
## [8] datasets methods base
##
## other attached packages:
## [1] L1Graph_0.1.1 lpSolveAPI_5.5.2.0-17 bindrcpp_0.2.2
## [4] ggrastr_0.1.7 DT_0.5 reshape2_1.4.3
## [7] viridis_0.5.1 viridisLite_0.3.0 NNLM_0.4.2
## [10] dplyr_0.7.7 gridExtra_2.3 pheatmap_1.0.10
## [13] VGAM_1.0-5 reticulate_1.10 monocle_2.99.1
## [16] DDRTree_0.1.5 irlba_2.3.2 igraph_1.2.2
## [19] DelayedArray_0.6.6 BiocParallel_1.14.2 IRanges_2.14.12
## [22] S4Vectors_0.18.3 matrixStats_0.54.0 stringr_1.4.0
## [25] cellrangerRkit_2.0.0 Rmisc_1.5 plyr_1.8.4
## [28] lattice_0.20-35 bit64_0.9-7 bit_1.1-14
## [31] ggplot2_3.1.0 RColorBrewer_1.1-2 Biobase_2.40.0
## [34] BiocGenerics_0.26.0 Matrix_1.2-14
##
## loaded via a namespace (and not attached):
## [1] Rtsne_0.13 colorspace_1.4-0
## [3] deldir_0.1-15 ggridges_0.5.1
## [5] rprojroot_1.3-2 listenv_0.7.0
## [7] ggrepel_0.8.0 fansi_0.4.0
## [9] codetools_0.2-15 docopt_0.6.1
## [11] doParallel_1.0.14 knitr_1.20
## [13] jsonlite_1.5 cluster_2.0.7-1
## [15] shiny_1.1.0 compiler_3.5.1
## [17] backports_1.1.2 assertthat_0.2.0
## [19] lazyeval_0.2.1 cli_1.0.1
## [21] limma_3.36.5 later_0.7.5
## [23] htmltools_0.3.6 tools_3.5.1
## [25] coda_0.19-2 gtable_0.2.0
## [27] glue_1.3.0 RANN_2.6
## [29] gmodels_2.18.1 Rcpp_1.0.0
## [31] slam_0.1-43 spdep_0.7-9
## [33] gdata_2.18.0 nlme_3.1-137
## [35] DelayedMatrixStats_1.2.0 iterators_1.0.10
## [37] crosstalk_1.0.0 globals_0.12.4
## [39] mime_0.6 miniUI_0.1.1.1
## [41] gtools_3.8.1 future_1.10.0
## [43] LearnBayes_2.15.1 MASS_7.3-51
## [45] scales_1.0.0 promises_1.0.1
## [47] rhdf5_2.24.0 expm_0.999-3
## [49] yaml_2.2.0 pbapply_1.3-4
## [51] fastICA_1.2-1 stringi_1.3.1
## [53] foreach_1.4.4 densityClust_0.3
## [55] boot_1.3-20 manipulateWidget_0.10.0
## [57] spData_0.2.9.4 rlang_0.3.1
## [59] pkgconfig_2.0.2 rgl_0.99.16
## [61] qlcMatrix_0.9.7 evaluate_0.12
## [63] purrr_0.2.5 Rhdf5lib_1.2.1
## [65] bindr_0.1.1 labeling_0.3
## [67] htmlwidgets_1.3 tidyselect_0.2.5
## [69] magrittr_1.5 R6_2.4.0
## [71] pillar_1.3.1 withr_2.1.2
## [73] sp_1.3-1 tibble_2.0.1
## [75] crayon_1.3.4 utf8_1.1.4
## [77] rmarkdown_1.10 grid_3.5.1
## [79] data.table_1.11.8 FNN_1.1.2.1
## [81] HSMMSingleCell_0.114.0 sparsesvd_0.1-4
## [83] digest_0.6.18 webshot_0.5.1
## [85] pbmcapply_1.2.5 xtable_1.8-3
## [87] httpuv_1.4.5 munsell_0.5.0
## [89] glmnet_2.0-16